Руководитель: В.Н.С., К.Б.Н. Михеева Лидия Евгеньевна

 коллектив: 

• в.н.с., к.б.н. Михеева Лидия Евгеньевна   
• в.н.с., к.б.н. Карбышева Елена Алексеевна
• н.с. Женавчук Оксана Федоровна
• асп. Емец Елизавета Владимировна       

Объект исследования 

       Модельный штамм Trichormus (Anabaena) varibilis ATCC 29413 более 40 лет интенсивно изучается во многих лабораториях мира с целью расшифровки механизмов азотфиксации, фотосинтеза, метаболизма водорода и дифференцировки клеток. На кафедре генетики работа с этим штаммом, полученным из лаборатории П.Уолка (Мичиган), ведется с 1978 года.

      Также в нашей лаборатории создана коллекция (около 120 штаммов) новых природных изолятов азотфиксирующих цианобактерий порядка Nostocales, выделенных из биоценозов в различных географических и климатических зонах – Подмосковье, Якутия, Коми, Байкал, Тыва и др., включая 22 штамма из образцов гиполитного слоя грунта Восточной Антарктиды. С помощью морфологической и первичной таксономической идентификации по последовательности генов 16S рРНК новые изоляты цианобактерий отнесены к р.Nostoc, Anabaena, Trichormus, Cylindrospermum, Tolypothrix, Calothrix, Halotia и др.

Основные направления научной работы:

1. Конструирование и изучение мутантных штаммов цианобактерии Anabaena variabilis ATCC29413, продуцирующих аммоний и молекулярный водород

        В нашей лаборатории у штамма Anabaena variabilis ATCC 29413 с помощью химического мутагенеза были выделены уникальные мутанты с измененными процессами азотфиксации и метаболизма водорода:

1). Дерепрессированные по нитрогеназе мутанты (устойчивые к аналогу аммония – этилендиамину) способны выделять в среду роста ионы аммония, образующиеся в результате азотфиксации, со скоростью 100 - 150 мк моль NH4+ / мг хлорофилла в час. В наших работах предложено использовать для иммобилизации цианобактерий алюмоборосиликатное волокно (рис. 1), что увеличивает выход аммония в несколько раз - до 300 мк моль NH4+ / мг хлорофилла в час в периодическом реакторе.

Секвенирование гена glnA, кодирующего первый фермент пути ассимиляции аммония у цианобактерий – глутаминсинтетазу, выявило мутации в этом гене у всех этилендиамин-устойчивых мутантов.

2). Штаммы, продуцирующие водород в аэробных и анаэробных условиях в результате снижения активности поглощающей гидрогеназы, которая в клетках дикого типа  рециклизует водород, образующийся в процессе азотфиксации (рис. 2).

      Совместно с Центром Биоинженерии РАН методом пиросеквенирования проведен полногеномный анализ мутанов РК17 и РК84, и выявлены мутации в генах, контролирующих активность водород-поглощающей гидрогеназы – hupL и hypF, и в ряде других генов, способных влиять на активности нитрогеназы и / или гидрогеназы.

    Полученные результаты являются основой для направленного получения эффективных водород-продуцирующих селективно-поддерживаемых мутантных штаммов путем совмещения в одном геноме инсерционных мутаций по генам, влияющим на активность нитрогеназы и поглощающей гидрогеназы (рис. 3).

Рис. 1. Иммобилизованные на алюмоборосиликатном волокне (справа) дерепрессированные мутанты выделяют в 2-3 раза больше аммония, чем в суспензионной культуре (слева).

Рис. 2. Тест на способность культур выделять водород в микроаэрофильных условиях показывает, что мутанты 17 и 84 выделяют в 3-4 раза больше водорода, чем исходный штамм дикого типа (w.t.). Иммобилизация культур также увеличивает выход водорода.

Рис. 3. Схема экспериментов по генетическому конструированию новых мутантных штаммов Anabaena variabilis с высоким уровне продукции водорода

2. Выделение новых штаммов азотфиксирующих цианобактерий из различных экотопов и климатических зон.

     Целью данной работы является выделение новых штаммов-изолятов гетероцистных цианобактерий порядка Nostocales из различных географических зон и их комплексное сравнительное изучение,  направленное на оценку биоразнообразия гетероцистных цианобактерий в различных климатических зонах и биотопах и анализ основных адаптационных механизмов у широкой группы представителей этой уникальной группы прокариот.

    Отдельным направлением работы являлся отбор штаммов, способных к образованию ассоциации с растениями печеночных и листостебельных мхов из различных регионов, и дальнейший анализ их способности стимулировать рост растений в модельных экспериментах. Наиболее перспективными в этом отношении являются изоляты Trichormus variabilis, выделенные как ассоциативные из проб растений мхов Marchantia polymorpha, Dicranum scopаrium, Polytrichum strictum и Sanionia uncinata, что согласуется с имеющимися данными о космополитизме данного вида и его способности к эпифитному и ассоциативному взаимодействию с мхами, папоротником Azolla, рисом и др. 

     В нашей лаборатории Trichormus variabilis является модельным штаммом при создании мутантов-продуцентов аммония, молекулярного водорода и биологически активных веществ. Показано, что полученные мутантные штаммы с дерепрессированным процессом азотфиксации способны стимулировать рост растений, при этом полученный эффект может быть связан с повышенным уровнем продукции ауксино- и гибберелино-подобных веществ. Все это делает данные штаммы наиболее перспективными объектами агробиотехнологии.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - изучение генетического разнообразия штаммов нитчатых гетероцистных цианобактерий, а также получение перспективных мутантных штаммов-продуцентов.

Возможные темы выпускных работ бакалавра и магистра:

• Генетическая идентификация новых штаммов азотфиксирующих цианобактерий порядка Nostocales, выделенных из разных климатических зон